Z ligacijo preko topih koncev smo izolirane produkte vstavili v klonirni vektor pJET in skladnost zaporedja potrdili z določitvijo nukleotidnega zaporedja.

Z agarozno gelsko elektroforezo smo ločili fragmenta ustreznih velikosti, ki smo ju izolirali iz gela ter izvedli ligacijo.

Vsi encimi po delovanju povzročijo lepljive konce (angl. sticky ends) in s tem omogočijo selektivno hibridizacijo in ligacijo ustreznih adapterjev.

Volumne za ligacijo smo izračunali glede na izmerjene koncentracije, na dolžino posameznih insertov ter na dolžino samega vektorja.

Vektor vsebuje smrtonosni gen, ki se z uspešno ligacijo vključka v klonirno mesto prekine.

V primeru uspešne hibridizacije na tarčno zaporedje se oligonukleotida med ligacijo združita v eno samo sondo.

V nadaljevanju smo z ustrezno rezanima in prečiščenima fragmentoma izvedli ligacijo v ustrezno predpripravljen ekspresijski vektor.

Uporaba zgolj enega encima namreč povečuje tveganje, da se lineariziran plazmid med ligacijo ponovno zapre sam vase, brez vključitve mutiranega fragmenta.

Transmembransko domeno smo torej izrezali z eno samo restriktazo, rezane plazmide pa smo nato z ligacijo recirkularizirali.

Tako smo lahko sestavili najbolj optimalno mešanico za ligacijo.

Tako smo konce plazmida in fragmentov pripravili na ligacijo.

Tako pripravljenim fragmentom z ligacijo dodamo adapterska zaporedja.

Tako pripravljena fragmenta sta bila nato pripravljena za ligacijo z ustreznimi vektorji.

Slika nam kaže pzitivne rezultate, torej smo naš vektor linearizirali in ga pripravili za ligacijo s fragmenti.

S tem smo omogočili nastanek lepljivih koncev, ki so pomembni za uspešno ligacijo.

Produkte restrikcije smo preverili na gelu in ju izolirali za ligacijo.

Pripravili smo mešanico za ligacijo in encimsko restrikcijo.

Pred ligacijo smo morali izmeriti koncentraciji rezanega plazmida in rezanega fragmenta.