MasterMix reagent (MMX) je koncentrirana raztopina Taq DNA polimeraze in vseh ostalih komponent, potrebnih za PCR; Olig. zač. je oligonukleotidni začetnik); ddH20 je dvojno destilirana voda; dNTP mix je mešanica deoksinukleotid trifosfatov.

Nato smo pripravili reakcijsko mešanico za revezno transkripcijo, ki je vsebovala 2 µl vode, 4 µl 10-kratnega pufra za reverzno transkripcijo, 2 µl 2.5 mM dNTP Mix in 8 µl Ion RT Primer v2.

Sestava 2xRT master miksa je bila: - 10x RT pufer; - 25x deoksinukleotidni miks (dNTP mix, 100 mM); - 10x RT random primers; - 1,0 µl/vzorec multiscribe reverse transcriptase; - 1,0 µl/vzorec RNAse inhibitor; - voda brez nukleaz; - 1000 ng/10 µl RNA.

Reagent 10x RT pufer 25x mešanica deoksinukleotidov (dNTP mix) 10x naključni RT oligonukleotidni začetnik (RT random primer) encim reverzna transkriptaza

HiFi polimeraza dNTP mix (10 mM oz. 2,5 mM vsak dNTP) ONZ smerni [20 μM] ONZ protismerni [20 μM] 100-krat redčen amplikon 1. kroga Končni volumen

V 10 μl vzorca tretiranega z DNAzo je bilo dodano 2 μl 10x RT pufra, 0,8 μl 25x dNTP Mix (100 mM), 2 μl 10x RT naključnih primerjev, 1 μl encima MultiscribeTM reverzne transkriptaze, 1 μl RNaznega inhibitorja in 3,2 μl vode.

Komponenta 5x PCR pufer MgCl2 (25 mM) dNTP mix (10 mM)

Fast Start High Fidelity polimeraza dNTP mix (10 mM oz. 2,5 mM vsak dNTP) ONZ smerni [20 μM] ONZ protismerni [20 μM]

PCR-grade dNTP mix (10 mM, Qiagen, Nemčija; kat. št. 201900) (40)

Preglednica 4: Reagenti, uporabljeni v 25 µL reakciji PCR Table 4: Table: Reagents, used in 25 µL PCR reaction Komponenta Voda brez nukleaz 5x pufer 10mM KAPA dNTP mix milRNA-specifični zač. olig.

Dimethyl sulfoxide Di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder dNTP Mix Nitric acid Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate

V mikrocentrifugirko volumna 200 μl smo odpipetirali 21 μl 10X RT Buffer, 8,4 μl raztopine 25X dNTP Mix (100 mM), 21 μl 10X RT Random Primers in 10,5 μl raztopine z encimom MultiScribe™ Reverse Transcriptase.

Nuclease-free H20 pufer PCR GoTaq Flexi MgCl2 dNTP mix

Nuclease-free H20 PCR pufer GoTaq Flexi MgCl2 dNTP mix

Reakcijska mešanica za en vzorec je vsebovala:  2,5 µl pufra 10x RT,  1 µl mešanice 25x dNTP Mix,  2,5 µl naključnih heksamerov RT,  4,25 µl vode brez RNaz,  1 µl inhibitorja RNaz,  1,25 µl reverzne transkriptaze MultiscribeTM.

Diaminopimelic acid) DEPC voda DNA Gel Loading Dye 6 × dNTP Mix (10 mM)

KAPA Library Quantification Kit PFU turbo DNA Polymerase dNTP Mix with dTTP