Začetna oligonukleotida sta omogočila sintezo komplementarnih verig fagmida s točkovno mutacijo, v zmesi pa je bila še vedno prisotna originalna matrica.

Z izrezom inserta z robnimi zaporedji se poenostavi bioinformacijska analiza rezultatov sekvenciranja napram sekvenciranju celotnega fagmida.

Ta korak poskrbi za bolj efektivno lizo celic in večji donos pri izolaciji fagmida.

Pri tem sistemu potrebujemo pomožni bakteriofag za pakiranje fagmida v virione s fuzijskim proteinom.

O tem tipu govorim tudi pri bakteriofagni predstavitvi na osnovi fagmida.

Nato smo za nadaljnjo analizo izbrali le odčitke iz področja fagmida z inserti.

Ker poznamo pričakovano dolžino in nukleotidno zaporedje fagmida, poznamo tudi dolžino segmentov ob rezanju fagmida z restrikcijskimi endonukleazami.

Na sliki 12 je razvidno, da so vzorci po reakciji restrikcije krajši od nerezanega fagmida, hkrati pa lahko na gelu opazimo dva fragmenta.

Vse fage smo pripravili na osnovi originalnega fagmida pIT2 (tj. z dolgim povezovalnim peptidom, medpeptidom in sidrnim proteinom p3).

Tip 8+8 obsega uporabo dveh vektorjev, tj. fagmida in pomožnega bakteriofaga.

Zato smo po optimizaciji priprave elektrokompetentnih celic še enkrat preverili učinkovitost elektroporacije pri količinah fagmida 5 ng in 200 ng.

Uporaba kombinacije fagmida tipa 3+3 ali 8+8 in pomožnega faga še dodatno zmanjša valenco predstavitve in olajša sestavljanje virionov.

V optimiziranem protokolu elektroporacije za pripravo knjižnice smo zato uporabili 200 ng fagmida.

V primeru fagmida pIT2 je distančnik dolg 27 aminokislinskih ostankov.

Sprva smo elektroporacijo izvedli z 1 μL raztopine fagmida s koncentracijo 0,1 ng/μL, 1 ng/μL, 5 ng/μL in 10 ng/μL.

Okvara na mestu ORI pomeni, da število vektorjev pomožnega virusa ostane nizko, zato ima pri pakiranju virusov prednost genski material fagmida.

V klonirno regijo fagmida smo genu za p3 s pomočjo tehnologije rekombinantne DNA pripojili zapis za krajše peptidne ligande.

Določili smo koncentracijo knjižničnih fagov 3,87×1013 virionov/mL in koncentracijo izoliranega fagmida 101,4 ng/μL.

Po končanem postopku smo spektrofotometrično izmerili koncentracijo ter čistoto lineariziranega fagmida ter ga shranili pri -20 °C.

Odčitke iz eluiranih frakcij smo nalegali na zaporedje 'praznega' fagmida (pIT2-SL/stuffer) s programsko opremo bwa mem aligner173.