Za nadaljnje poskuse smo potrebovali protein s končno prosto signalno sekvenco, zato smo z encimom enterokinaza odstranili histidinski repek s proteinov.

Vsi plazmidni konstrukti vsebujejo signalno zaporedje srT in zaporedje za poli-histidinski repek (his-tag).

V tem primeru so histidinski aminokislinski ostanki prisotni na mestih d v heptadni ponovitvi.

V prvem koraku histidinski ostanek deprotonira tiolno skupino cisteina.

V obeh primerih rumenega obarvanja, kar je tipično za histidinski pufer, izpostavljen stresnim pogojem, kot sta temperatura ali svetloba, nismo opazili.

V notranjosti celice se nahaja histidinska fosfotransferazna domena, ki ob zaznavi signala avtofosforilira histidinski rep.

V mehanizmu, kot druga aminokislina, sodeluje tudi donor protona, kar po navadi predstavlja bazičen histidinski ostanek.

Uporabljeni histidinski pufer je bil sestavljen iz histidina, ki je šibka baza in soli močne kisline s histidinom.

Priprava načrtovanih formulacij je potekala tako, da smo najprej naredili raztopine treh različnih pufrov (citratni, acetatni in histidinski) z želenim pH.

Pri vseh petih klonih je afiniteta vezave na protitelesa proti histidinski oznaki presegala afiniteto do tarčnega encima.

Pozitivni naboj proteinom običajno dajejo ionizirani cisteinski, aspartatni, lizinski in histidinski ostanki, k negativnemu pa v glavnem doprinesejo ostanki aspartata in glutamata.

Poleg tega lahko histidinski pufri zmanjšajo viskoznost raztopine, kar je še posebej pomembno pri proizvodnji visoko koncentriranih proteinskih formulacij.

Po nekajminutni inkubaciji v raztopini so se na membrani pojavile vijolično obarvane lise, kjer je prišlo do vezave protiteles na histidinski označevalec.

Obe spojini ireverzibilno alkilirata histidinski ostanek v aktivnem mestu serinskih proteaz in nespecifično inhibirata serinske proteaze.

Na sliki so razvidni tudi cisteinski in histidinski ostanki, ki so odgovorni za koordinacijo cinkovega iona (siva krogla).

Membrano smo nato izpostavili specifičnim protitelesom proti histidinski oznaki, ki se je izrazila skupaj z izbranim površinskim proteinom.

Ker se je naš protein vezal na kolono, pomeni, da je histidinski repek še prisoten in ga nismo cepili s trombin safarazo.

Izražanje obeh citokin-vezavnih fuzijskih proteinov smo potrdili z metodo prenosa western in uporabo protiteles proti histidinski oznaki.

Iz bakterijskega produkcijskega seva smo s pomočjo nikelj afinitetne kromatografije izolirali načrtovane nanostrukture, ki so imele histidinski označevalec.