Rezultate smo predstavili grafično kot delež pozitivnih celic iRFP in srednjo intenziteto fluorescence iRFP pri različnih delecijskih konstruktih aksina.

Med transfekcijo smo v vse celice dodali še infrardeči fluorescenčni protein (iRFP), ki služi kot kontrola uspešnosti transfekcije.

Konstitutivno izražen iRFP smo uporabili kot kontrolo transfekcije in za vizualizacijo celic.

Ker proizvaja fluorescenco v delu spektra blizu infrardečega, z iRFP ne vplivamo na rezultate preurejanja genoma.

Intenziteto signala fLuc smo normalizirali na intenziteto signala iRFP znotraj izbranega območja zanimanja.

Intenziteto luminiscence kresničkine luciferaze smo normalizirali na fluorescenco iRFP, da smo odpravili razlike v luminiscenci zaradi razlik v transfekciji in globini implantacije.

Kot kontrola uspešnosti transfekcije so nam služile celice transficirane le s praznim vektorjem pcDNA3 in iRFP.

Pokazali smo, da je bila transfekcija celic uspešna, saj v vseh primerih opazimo izražanje fluorescentnega proteina iRFP (slika 11).

Pri tem smo uporabili specifična začetna oligonukleotida, ki se prilegata eden na ekson 50, drugi pa na zapis za protein iRFP.

Poleg fluorescence poročevalnih proteinov mCIT in iRFP smo z omenjeno metodo merili tudi fluorescenco proteina BFP, ki je služil kot kontrola transfekcije.

Pri miših z intraperitonealno transplantiranimi celicami smo pred aplikacijo D-luciferina izmerili fluorescenčni signal proteina bližnjega infrardečega spektra (iRFP).

Biliverdin služi kot kofaktor za IRFP in mora biti prisoten med samo ekspresijo, da se lahko vgradi v protein.

Delež celic pozitivnih na iRFP/YFP smo odčitali iz rezultatske preglednice, ki jo je izdelal program pretočnega citometra.

C: Določitev iRFP pozitivnih celic, ki fluorescirajo v delu spektra blizu infrardečega in predstavljajo odstotek uspešno transfeciranih celic.

Med drugim se uporabljajo zeleni fluorescenčni protein, rdeči fluorescenčni protein in njegova izboljšana različica mCherry ter infrardeči fluorescenčni protein (IRFP) (78).

Program nato izdela spektralen podpis posameznega fluorofora (YFP ali iRFP), ki vsebuje podatke iz pozitivne populacije celic.

Za vzbujanje iRFP smo uporabili 633 nm helij-neonov laser in signal spremljali med 580 in 620 nm.

Plazmid omogoča konstitutivno izražanje fluorescenčnega proteina bližnjega infrardečega spektra (iRFP), ki je pod nadzorom promotorja CMV.

Analiza s pretočno citometrijo je pokazala visoko učinkovitost transfekcije, pri čemer je izražanje iRFP kot poročevalnega proteina v povprečju presegalo 80 % (Slika 15).

Analizirali smo jakost signala fluorescence proteina YFP, na celicah, ki so izražale protein iRFP.