NanoBiT ® preizkusi temeljijo na sistemu dveh podenot , na osnovi NanoLuc ® luciferaze , ki se lahko uporablja za znotrajcelično odkrivanje interakcij protein : protein .

NanoLuc na polistirenski površini Za kvantifikacijo na polistirensko površino pritrjenih in biofilmskih celic smo uporabili metodo merjenja bioluminiscence celic.

Tako smo uspešno določili konstanto disociacije in pokazali potencialno izpodrivanje obvitih vijačnic z oprimkom z metodo razdeljene NanoLuc.

Furimazin se v reakciji, ki ga katalizira NanoLuc luciferaza, oksidira v furimamid in sprosti energijo v obliki bioluminiscence.

Kasneje so z mutagenezo spremenili podenoto in razvili nov substrat furimazin, ter s tem ustvarili luciferazo NanoLuc.

Na koncu so izolirali modificiran fagni genom in potrdili predvideno mesto vstavitve proteina NanoLuc s sekvenciranjem.

S homologno rekombinacijo so v fagni genom vstavili nov komercialni protein NanoLuc, ki oddaja 100-krat večji signal kot tradicionalna luciferaza.

Medtem ko signal NanoLuc ob celični razgradnji hitro izzveni, fluorescentni signal ostaja prisoten dlje časa.

V tem delu smo pripravili vektorski konstrukt z genom za luciferazo NanoLuc, ki smo ga poimenovali pMW10_nLuc.

Kot dodaten eksperiment, smo dokazali delno izpodrivanje obvitih vijačnic s pomočjo oprimka z NanoLuc.

Z razdeljeno luciferazo NanoLuc nam je uspelo določiti konstanto disociacije v nanomolarnem območju.

S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm .

Uspešni titraciji z NanoLuc je sledil poskus izpodrivanja obvitih vijačnic z oprimkom.

V magistrskem delu smo oblikovali plazmid pMW10_nLuc s konstitutivnim izražanjem luciferaze NanoLuc.

Ugotovili smo, da je gibljivost seva C. jejuni NanoLuc močno zmanjšana v primerjavi z divjim tipom, kar najverjetneje vpliva na tvorbo biofilma.

V plazmid pMW10 smo vstavili gen za luciferazo NanoLuc in tako dobili nov plazmid pMW10_nLuc.

Za določitev konstante disociacije smo se odločili za dve metodi - razdeljeno luciferazo NanoLuc ter s prenosom energije z resonanco fluorescence (FRET).

Hipotezo 2 potrdimo, saj je vpeljana metoda merjenja bioluminiscence transformiranih bakterij C. jejuni NanoLuc omogočala ponovljivo in specifično metodo kvantifikacije.

Na skrajni desni na Sliki 7 vidimo končni vektorski konstrukt z genskim vključkom NanoLuc, ki je označen z rumeno barvo.

Po nam znanih podatkih je to prvi primer uspešne transformacije in izražanja gena NanoLuc v organizmu C. jejuni.