Z ekspresijsko analizo smo v naslednjem koraku preverili potencialno tkivno specifično izražanje potrjenih milRNA z metodo absolutne kvantifikacije števila molekul milRNA.

Vrednosti smo dopisali v preglednico, kamor smo dopisali dolžino zrele milRNA ter zaporedje zrele milRNA za vsak posamezen analiziran prekurzor.

V zadnjih letih so sRNA in milRNA intenzivno preučevane na ravni interakcij gostiteljpatogen.

V okviru potrjevanja izražanja milRNA smo izvedli tudi analizo tkivno specifičnega izražanja milRNA z absolutno kvantifikacijo števila molekul milRNA.

Sočasno smo napovedali predpostavljene tarče identificiranim glivnim milRNA v transkriptomu hmelja.

Raven izražanja milRNA smo določili z metodo absolutne kvantifikacije z uporabo standardne krivulje, izdelane na podlagi pomnoževanja standarda miRNA v reakciji qPCR.

Pri tem smo kot glavni kriterij upoštevali zahtevo, da v regiji "seed" ni neujemanj med zaporedjem milRNA ter zaporedjem tarčne mRNA.

Prav tako so identificirali številne hmeljeve transkripte, ki so tarče različnim že znanim glivnim milRNA molekulam.

Prav tako smo želeli preučiti vlogo milRNA v glivi z identifikacijo predpostavljenih tarč v genomu glive in identificirati morebitne tarče transkriptov hmelja.

Nazadnje pa so v genomu glive in v transkriptomu hmelja s pomočjo bioinformacijskih orodji določili tarče tem devetim milRNA.

Na podlagi zbranih rezultatov bioinformacijske analize milRNA in sRNA ter eksperimentalne validacije milRNA hipotezo potrjujemo.

Med zaporedjem milRNA ter njenim komplementarnim zaporedjem milRNA* smo ročno prešteli neujemanja med nukleotidi in vrednost dopisali v preglednico.

Glavna tematika magistrskega dela je interakcija omenjene patogene glive z rastlino hmelja na nivoju delovanja glivnih milRNA in hmeljevih tarčnih transkriptov mRNA.

Datoteke unikatnih zaporedij smo nadaljnje uporabili pri napovedovanju prekurzorjev milRNA.

Sintetizirane cDNA smo ustrezno redčili ter po 1 µL uporabili za reakcije qPCR z milRNA-specifičnimi začetnimi oligonukleotidi.

Nato smo podatke filtrirali glede na število neujemanj med zaporedjema milRNA in milRNA*, ki ne sme presegati 6 neujemanj.

Sočasno smo preverili učinkovitost qPCR z dodatkom 2 µL cDNA v reakcijo pomnoževanja milRNA.

Odločitev je temeljila na cenovni nedostopnosti sond, saj bi potrebovali najmanj 27 specifičnih sond za analizo izbranih kandidatnih milRNA.

Za 13 milRNA, ki so imele zadetek v podatkovni zbirki, pa smo dopisali število zadetkov ter imena homologov znanih miRNA.

Po delovanju glivne milRNA dobimo namreč dva fragmenta, 5' in 3' fragment mRNA ki sta posledica razreza.