Sklepamo, da bi predvsem modifikacije propeptida lahko pripomogle k topnosti proMpl, vendar kot že omenjeno, propeptida pri tem ne bi popolnoma odstranili.

S tem onemogočimo morebitno aktivacijo proMpl, ki se sicer aktivira pri nizkem pH.

Rezultati pokažejo, da se proMpl nahaja v netopni frakciji, neodvisno od sestave liznega pufra.

Pripravili bomo tudi proMpl z mutacijo v aktivnem mestu.

Predpostavili smo, da bi lahko pomanjkanje cinka v gojišču vodilo v neustrezno zvitje proMpl.

Potrdimo lahko tudi prisotnost v netopni frakciji, medtem ko v topni frakciji proMpl praktično ni.

Posledično ima tako proMpl manj interakcij, ki bi lahko vodile v agregacijo.

Opazili smo veliko nestrukuriranih delov (označeni s puščicami), ki bi lahko bili razlog za netopnost proMpl.

Najvišja koncentracija je bila dodana kot kontrola, saj smo le-to uporabili pri prejšnjih izražanjih proMpl.

Največji fragment predstavlja proMpl, medtem ko najmanjši fragment ustreza prodomeni.

Modeli napovejo nestrukturirane dele v propeptidu, ki bi lahko povzročali netopnost rekombinantno izraženega proMpl.

Iz teh rezultatov vidimo, da sta bila oba proteinska konstrukta s proMpl slabo topna, zato smo se odločili za spremembo protokola.

Gen za proMpl smo klonirali v štiri različne vektorje (tabela 1).

V vseh primerih je proMpl po soniciranju v netopni frakciji, prav tako se pojavi tudi neznan protein velikosti 40 kDa.

V nizkem pH okolju se proMpl lahko aktivira65, kar pa ne želimo na tej stopnji izolacije tarčnega proteina.

Po neuspelih poskusih solubilizacije proMpl, smo se odločili za uporabo vektorja pET22b(+).