Za eksperimentalni poskus smo pripravili različne sgRNA za izbrana tarčna mesta na lokusih, na katerih smo preverjali stopnjo preurejanja tarčnih baz.

Vse izbrane sgRNA delujejo v konsenznih regijah, tako da so ustrezale vsem uporabljenim sortam.

Vsak sgRNA je bil načrtovan na začetku kodirajočega dela eksona, da smo preprečili morebitno izražanje daljše nefunkcionalne ali disfunkcionalne oblike proteina.

Vodoravno črno podčrtano območje predstavlja vodilno zaporedje sgRNA.

Vloga ribocimov je, da sprostita sgRNA iz prepisa.

Vektorji so nosili zapis za sgRNA in shRNA, ki smo jih predhodno identificirali kot delujoče.

V poskusih smo uporabili tudi sgRNA za induciranje tarčnih mutacij v genih fri in pds.

V nadaljevanju smo dobljeni zaporedji prilagodili zahtevam reagenčnega kompleta za sintezo sgRNA.

Učinkovitost sgRNA smo preverili z in vitro cepitvijo tarčne regije z uporabo ribonukleo-proteinskega kompleksa (angl.

Urejanje genov v celičnih linijah pred poskusi in vivo je potrebno za določitev specifičnosti sgRNA in določiti učinkovitost samega sistema.

Tranzietni način ekspresije nam je omogočal relativno hitro identifikacijo učinkovitih sgRNA na mRNA nivoju.

To pa lahko nakazuje na omejitev samega sistema ali slabšo učinkovitost izbrane sgRNA molekule.

The horizontal black underlined area represents the sgRNA guide sequence.

Sočasno smo v celice vstavili tudi plazmid z zapisom za sgRNA.

S čiščenjem smo želeli odstraniti proteine, pufre, soli in nukleotide, ki so bili prisotni pri sintezi sgRNA.

S tem smo odprli plazmid in ga pripravili za sprejem konstrukta sgRNA.

S programom smo v promotorski regiji tarčnega gena predvideli mesta za vezavo sgRNA, kjer predvidoma nalegajo tudi transkripcijski dejavniki.

Rezultat je bila tabela možnih zaporedij, iz katerih lahko nato sinteitiziramo sgRNA.

Replikazno-transkriptazni kompleks poganja podvojevanje genoma in transkripcijo sgRNA (ang.

Regulacija vsake sgRNA določa tudi izražanje in s tem interakcijo s celičnimi komponentami.